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试着抛砖引玉:纳米通道用来测整根染色体的DNA序列困难重重

送交者: 黄叶 于 August 11, 2002 14:01:44:[新观察/xgc2000.net]

试着抛砖引玉:纳米通道用来测整根染色体的DNA序列困难重重


要将整根染色体的DNA链装到纳米管中,先得找到分子链的末端,然
后用纳米镊子将端头拎出来。纳米镊子已经有了,但抓住两纳米大小
的东西还有些困难。在有几千万到几亿个硷基对的链条上中找到末端,
困难也不小。

找到末端后,人工将整个染色体不打结地展开,也不容易。人体染色
体DNA链最长的大约有10厘米,平均长度两三厘米。一根2厘米长度的
DNA链,相当于长度达100公里的一堆直径1厘米的绳子。想象一下在
这样一堆绳子中找到端头并将其拉伸的难度。

对於几百至几千个硷基对的链条,就容易得多。当这种短链在狭小空
间中随液体流动时,自然就会顺着流动方向展开成链状。U.S. Genomics
申请的专利中,就利用凝胶中的聚合物骨架形成的网络,或者是紧密
堆积的几十纳米的小球之间的空隙,通过液体流动来展开链状分子。
但对於长几万倍的分子链,这种方法就不行了。巨大的分子不会像短
链那么容易地随着液体流动自动伸展开。

在跟分子直径相近的管道中,分子跟管壁的作用力无法忽略。假设一
个染色体的DNA分子在纳米管中用电场拉直了,在电场下有沿着链分
布比较均匀的拉力,还有分布不怎么均匀的阻力。对短链而言,这个
阻力很小,不会有什么影响,对非常长的链,这个力就不小了,由于
不均匀分布,某时刻在某一点完全可能将链拉断。尤其是对上一段说
到的方法。

哈佛大学的一个小组则研究用纳米孔来测DNA序列。他们在很薄的膜
上加工出纳米孔,希望将DNA链条从孔中穿过,在孔边上装上电极用
电化学方法或者别的光学方法来进行测序。这就比纳米通道的阻力小
得多,不太可能会出现拉断分子链的情况。

单分子检测也是非常困难的。现在用于毛细管电泳的常规荧光法不可
能用在单分子链测序。

能用于毛细管电泳的激光是可见光或者近紫外光,波长几百纳米。常
规光学系统不能将光束聚焦到尺度小于波长的区域,这个区域的尺寸
至少有一千多个硷基对的链长尺度。即使采用微透镜,现在最好的水
平也只能聚焦到五分之一波长的尺度,这仍然有几百个硷基对的链长
尺度。因此,单分子DNA测序,必须用与毛细管电泳的完全不同的检
测方法。

其中一种方法是,将几万个硷基对大小的DNA分子一端固定在很小的
树脂球上,在流动的液体中,DNA分子伸展开来,然后用外切酶将一
条链上的硷基从游离端一个一个地切下来,每个切下来的核苷就按顺
序被流动相带走。通过检测流动相中的一个个核苷,就能得到DNA链
的序列。理论上速度可以达达到每秒10个硷基。如果将树脂球在一个
圆盘上的液体薄层上移动,切下来的硷基就留在圆盘上,那么DNA序
列就可以像放CD那样读出来。

问题仍然是单分子检测。科学家们还在试验各种各样的方法,比如低
温磷光、荧光增强效应、隧道扫描细微镜、原子力显微镜等等。

U.S. Genomics申请的专利则利用荧光共振能量转移(FRET)。如果
一种荧光染料的荧光谱,跟另一种荧光染料的吸收谱重迭,当这两种
染料分子靠得很近时,用第一种染料的激发波长的光照射,就能让第
二种染料发出荧光。能量转移效率最高的距离,通常在2-7纳米。

将一种染料固定在凝胶的骨架上或者纳米小球表面,当用另一种染料
标记的DNA通过凝胶或者小球,距离在2-7纳米时,在激发光束照射下,
就会有FRET荧光信号。U.S. Genomics试验的移动速度是每秒1万纳
米,接受到的荧光是每秒每个荧光染料分子1-10万个光子。如果这种
方法能测到每个硷基,速度可以达到每秒几千至几万个硷基对。但是
这种方法还没办法精确到每个硷基。DNA链上硷基对之间距离是0.34
纳米,发生FRET的距离内就可以有二十来个硷基对。而且,要能用此
法测序,必须只标记一条链上的每个硷基。荧光的效率也还不够高。
这些问题还没有解决。

现在最成熟的方法还是毛细管凝胶电泳。由於毛细管比表面大,散热
性好,可以应用很高的电压。电压越高,DNA分子移动越快,分析速
度也越快。毛细管直径只有几百微米,用的样品量小于1微升(立方毫
米)。能测的DNA分子大小不超过2000个硷基。将许多毛细管组合在一
起同时测序(如几百根),速度就加快很多。进一步减小毛细管的直径,
就可以加更高的电压,测序速度更快。

有的科学家在一块玻璃板上刻出几百条微槽,盖上另一块玻璃烧结,
就形成毛细管。DNA扩增的聚合酶链反应(PCR)的反应池也同时做在
玻璃板里面。他们的目标是将DNA扩增和测序的所有过程都在一块板
上完成。

总而言之,测定单个染色体的DNA序列是一个艰巨的课题,到目前仍
然困难重重。




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